一、ELISA检测原理
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被,加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。
二、检测方法:
夹心法ELISA:
1、加样:将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔100 μL。待测样品加入到其他孔,每孔100 μL(若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜,37℃孵育90分钟。提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。
2、生物素化抗体/抗原:弃去液体,甩干,不用洗涤。每个孔中立即加入生物素化抗体/抗原工作液100 μL,混匀,酶标板加上覆膜, 37℃孵育1小时。
3、洗涤:甩尽孔内液体,每孔加洗涤液350 μL,浸泡1-2分钟,吸去或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。
提示:此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。
4、HRP酶结合物:每孔加酶结合物工作液100 μL,混匀,加上覆膜,37℃孵育30分钟。
5、洗涤:弃去孔内液体,洗板5次,方法同步骤3。
6、底物:每孔加底物溶液(TMB) 90 μL,混匀,加上覆膜,37℃避光孵育15分钟左右。提示:根据实际显色情况酌情缩短或延长孵育时间,但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。
7、终止:每孔加终止液50 μL,终止反应。提示:终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
8、读值:立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热,设置好检测程序。
9、 实验完毕后,将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至保质期。
竞争法ELISA:
1、加样:将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔50 μL。待测样品加入到其他孔,每孔50 μL(若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。立即每孔加入配好的生物素化抗体工作液50 μL。混匀,给酶标板覆膜,37℃孵育45分钟。提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。
2、洗涤:甩尽孔内液体,每孔加洗涤液350 μL,浸泡1-2分钟,吸去或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示:此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。
3、HRP酶结合物:每孔加酶结合物工作液100 μL,混匀,加上覆膜,37℃孵育30分钟。
4、洗涤:弃去孔内液体,洗板5次,方法同步骤2。
5、底物:每孔加底物溶液(TMB) 90 μL,混匀,加上覆膜,37℃避光孵育15分钟左右。提示:根据实际显色情况酌情缩短或延长孵育时间,但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。
6、终止:每孔加终止液50 μL,终止反应。提示:终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
7、读值:立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热,设置好检测程序。
8、实验完毕后,将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至保质期。
三、结果展示
四、客户提供材料
1、新鲜或正确保存的样品(按照我们的要求提供)
2、阳性对照样品(尽量提供)
3、相关文献(可选)
五、提交给客户结果
1、客户提供的实验样本
2、实验原始数据
3、完整实验报告
六、服务项目说明
1、ELISA实验我们按照标准实验要求:1000元/板,含有标准品+待测样本,至少做1个复孔
1、双方签订合同后,收取70%预付后启动预实验
2、有特殊要求请咨询:400-800-8458