实时荧光定量PCR(realtime-PCR)技术是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR检测常用的两种方法:染料法和TaqMan探针法。
一、实验原理
SYBR Green I 染料法
结合于dsDNA双螺旋小沟区域 ; 反应体系中游离的SYBR® Green I,几乎不发出荧光信号; 只有扩增过程中掺入双链DNA的才会发出荧光信号; 荧光信号强度与DNA分子数量成正比。
TaqMan探针法
TaqMan探针法核心是探针分子,TaqMan探针是单链DNA,5’端偶联发光基团,3’端偶联淬灭基团,游离的完整探针是检测不到荧光信号的,发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭,探针被水解,发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时,模板链经热变性解链形成单链,TaqMan探针优先跟模板链退火,引物随后退火到模板上,之后进行链的延伸,延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性,遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针,发光基团会跟淬灭基团分开,因此荧光检测系统可以接收到荧光信号,每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。
TaqMan探针法的特异性除了由引物提供,更由探针分子保证,因其退火温度更高,所以TaqMan探针法特异性更好,在一个反应体系中加入多条探针,可以做多个基因同时检测。
二、实验流程图
三、客户提供材料
1、新鲜或正确保存的样品(按照我们的要求提供)
2、检测基因信息,引物信息,内参要求(参考QPCR项目服务信息单)
3、相关文献(可选)
四、提交给客户结果
1、客户提供的实验样本
2、实验原始数据
3、完整实验报告
五、服务项目说明
1、双方签订合同后,收取70%预付后启动预实验
2、有特殊要求请咨询:400-800-8458