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增殖检测(CCK8/MTT)

细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下,通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等复杂反应而进行的分裂系列过程。其中核DNA的复制倍增是整个过程的重要特征。细胞增殖检测技术广泛应用于分子生物学遗传学肿瘤生物学免疫学药理和药代动力学等研究领域。
检测细胞存活与增殖的方法主要包括观察DNA合成含量和检测细胞代谢活性两种,前者主要有Brdu、EDU检测等,后者主要有MTT、CCK8等检测,客户可根据处理药物数量等因素选择合适的检测方法。

一、CCK8检测原理
Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析,细胞增殖越多越快,则颜色越深;毒性对细胞影响越大,则颜色就相对越淡。

二、检测方法:
实验一:细胞增殖分析
1、制备细胞悬液:细胞计数
2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。
4、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基,以换液的形式加入。
5、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。
6、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。
实验二:细胞毒性分析
1、制备细胞悬液:细胞计数
2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。
4、加入不同浓度的毒性物质
5、37℃培养箱中培养:加入毒性物质的培养时间,要看毒性物质的性质和细胞的敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要一代以上的时间。
6、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。
8、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。

注意事项
① 当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时     的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。
② 酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
③ CCK8可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染, 以免影响结果。
④ CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月,在-20℃下避光可以保存1年。
⑤ 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。一般情况下, 最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。
⑥ 在培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时,还应考虑药物的吸收,可在加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。
⑦ 金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话,将会100%抑制。
悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

三、结果展示

细胞增殖细胞毒性实验检测.jpg


四、客户提供材料
1、新鲜或正确保存的样品(按照我们的要求提供)
2、阳性对照样品(尽量提供)
3、相关文献(可选)

五、提交给客户结果
1、客户提供的实验样本
2、实验原始数据
3、完整实验报告

六、服务项目说明
1、按照标准实验要求:做4-8个复孔
1、双方签订合同后,收取70%预付后启动预实验
2、有特殊要求请咨询:400-800-8458

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